细胞凋亡又称为程序性细胞凋亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自然死亡的过程。目前认为细胞内有三条凋亡途径，即外源性途径、内源性途径和内质网途径，而内质网的凋亡信号途径往往归并于内源性途径，因此，也可以认为有两条主要的信号途径。但这三条凋亡途径都是通过活化半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)，最终集中到线粒体来执行凋亡的过程。本实验在前期研究的基础上研究补肾健脾中药复方对成骨细胞内Bcl-2、Bax和Bid的影响，以期探讨细胞凋亡信号和骨质疏松症的相关关系。

一、材料与方法

1、实验动物

健康新西兰兔6只，3月龄，体重～g，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证明编号：。所有新西兰兔均喂养在恒温、恒湿的清洁环境中喂养，环境温度为(25±1)℃，湿度为70%，自由活动，光照12h，黑暗12h。供给标准固体饲料(由广州中医药大学实验动物中心提供)，自由摄食水。实验过程中，对动物处置符合年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

2、实验药品

治疗组的药物采用补肾健脾中药复方，该方由补骨脂、制淫羊藿、肉苁蓉、熟地、白芍、黄芪、菟丝子、丹参、当归、大枣等组成。该方的提取药物，含生药量1.43g/ml，由广州中医医院制剂室提供。

对照组选用的药物为戊酸雌二醇片，由拜耳医药保健有限公司广州分公司提供(国药准字J，批号：A12)。

3、实验分组及给药方法

将6只健康新西兰兔随机分为3组，每组2只，分为正常组、治疗组和对照组。治疗组灌服补肾健脾中药复方，对照组灌服戊酸雌二醇,正常组灌服蒸馏水，灌胃给药容积为10ml/kg。用药量以成人的用量推算动物用量，根据人与动物及各类动物间药物剂量换算方法计算，其中治疗组的灌服药量为1.g/kg，对照组的灌服药量为0.mg/kg。

4、含药血浆的制备

大白免连续灌胃1周，最后一次灌胃后2h，分别行心脏采血，将获得的全血置于含抗凝剂的试管中，5～10min后，于r/min离心15min，吸取上清，即获取含药血浆，再灭活，抽滤除菌，置-20℃保存备用。

5、成骨细胞的分离、原代培养及传代

一日龄SD大鼠，75%酒精浸泡15min，取出头盖骨，剔净附着软组织，0.25%胰蛋白酶预消化，0.1%Ⅱ型胶原酶消化，离心，获取细胞，PBS液冲洗，置于含10%NCS-MEM培养液中，37℃、5%CO2中静置培养，每2天更换培养液1次，弃去原培养液，加入含10%的胎牛血清MEM进行培养，培养4～7天，单层细胞铺满培养瓶底。传代时，弃去原培养液，用D-Hank’s液冲洗，0.25%胰蛋白酶消化，弃去消化液，加入培养液，吹打培养瓶底，使细胞脱落，制成细胞悬液，接种于新的培养瓶，置37℃、5%CO2中静置培养。

6、加含药血浆培养及细胞增殖的测定

细胞按5×个/孔接种于24孔板内，接种第2天后，细胞分3组分别更换培养液培养：正常组、对照组和治疗组分别添加对应的含药血浆。每2天换液一次，连续培养1周。采用MTT比色法记录第2、4、6、8天各组细胞的OD值，波长为mm。

7、引物设计合成

GenBank上查找大鼠成骨细胞细胞株中Bcl-2和Bax的mRNA序列，设计特异性引物，所用软件为Primerexpress2.0软件。仪器为ABI台式高通量DNA合成仪。

8、指标检测方法及结果计算

对大鼠成骨细胞细胞株总RNA提取，抽提的总RNA应马上进行反转录：取2μlRNA模板做逆转录反应，仪器为普通PCR仪器K(杭州晶格科学仪器有限公司)反转录反应程序：30℃10min，42℃20min，99℃5min，4℃5min；取1μl反转录产物(cDNA)进行荧光定量PCR。

结果计算可按2-△△Ct来计算(具体公式推导可参考文献：KennethJ.LivakandThomasD.Schmittgen,利用实时定量PCR技术通过2-△△CT方法分析相对基因表达差异,METHODS25,–(.doi:10./meth..,availableonlineat







































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