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单细胞测序解密小胶质细胞在增殖性糖尿病视网膜病变纤维血管膜中的新角色

年1月21日，南京医院眼科刘庆淮教授团队采用单细胞测序技术揭示了小胶质细胞在增殖性糖尿病伴发视网膜病变（PDR）中的关键作用。在国际糖尿病领域顶级期刊《DIABETES》（IF:9.）上发表了题为“Single-celltranscriptomicsrevealsnovelroleofmicrogliainfibrovascularmembraneofproliferativediabeticretinopathy”的研究文章，本文胡仔仲博士、茅希颖博士为第一作者，袁松涛和刘庆淮教授教授为通讯作者。该课题对接受玻璃体切除手术的5例PDR患者的纤维血管膜进行剥离取样，获得单细胞悬液，通过单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）对糖尿病视网膜病变患者的纤维血管膜进行检测和分析。

增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）是糖尿病的主要并发症之一，在世界范围内仍是视力丧失严重的主要原因之一。纤维血管膜位于视网膜与玻璃体之间，可引起玻璃体出血和视网膜脱离，是PDR的重要病理标志之一。然而，目前对于PDR中纤维血管膜（FVM）的发病机制了解非常有限，甚至对于其上的细胞构成观点也有很大不同。传统的研究方法，如免疫组化只能对1-2个细胞表达的标志物探索，二代测序笼统地进行增殖膜整体测序，皆无法分析细胞的异质性；细胞和不成熟的动物模型都无法精确模拟PDR-纤维血管膜的病理过程。本研究利用单细胞测序对PDR患者的纤维血管膜组织进行单细胞重测序，揭示纤维血管膜的细胞异质性，并为解析PDR疾病的分子机制和靶向治疗提供理论基础。

研究团队从5例PDR患者玻璃体切除手术中分离获得纤维血管膜，共得到个细胞，通过注释发现8种细胞类型，包括小胶质细胞（MG）、单核细胞（Mono）、巨噬细胞(Macro)、成纤维细胞(Fibro)、周细胞(Peri)、内皮细胞(Endo)、树突细胞(DC)和T淋巴细胞(T)。其中MG亚群占比最大，平均占比63.02%，对MG亚群进一步细分，又可分为4个亚群：MG(1)、MG(2)、MG(3)、增殖性MG，分别特异性表达GPNMB、CX3CR1、SELENOP以及MKI67（图1）。

图1scRNA-seq分析鉴定小胶质细胞亚群为FAM主要细胞群

接着作者研究了纤维血管膜中小胶质细胞的分化来源。前人研究提示视网膜内小胶质细胞的活化可能来源于视网膜本身或血液系统中单核细胞的转分化。作者对人类视网膜组织、外周血单核细胞样本和纤维血管膜中小胶质细胞进行整合并进行拟时序分析，发现视网膜小胶质细胞和FVM中小胶质细胞较高的同源性。在视网膜小胶质细胞中高表达的CX3CR1(preactivemarker)在FVM小胶质细胞中显著降低，而之前鉴定出的几个小胶质细胞亚型中GPNMB+亚型在FVM小胶质细胞中显著增加（图2）。

图2FVM驻留小胶质细胞与视网膜小胶质细胞的相似性

为了进一步研究GPNMB+小胶质细胞在FVM上发挥的功能，作者利用基因组变异分析（GSVA）发现促纤维化相关基因表达显著富集，包括CTSB,SPP1和LGALS3等。GPNMB+小胶质细胞还高表达纤维连接蛋白(FN1)，骨连接蛋白(SPARC)和转化生长因子β诱导蛋白(TGFBI)等胞外基质相关基因（图3）。据此我们推测，GPNMB+小胶质细胞主要功能并不是介导免疫，而是促纤维化以及成纤维化的双重功能。

图3纤维血管膜中被激活的小胶质细胞的促纤维化特征

最后，PDR疾病微环境是如何作用于视网膜原位的小胶质细胞，促进其迁移并激活的呢？作者发现了PDR患者玻璃体中23种特异性升高的细胞因子，作为潜在的配体，分析了它们的受体在纤维血管膜不同细胞类型间的表达水平，发现NRP1、NRP2、TGFBR1和LRP1在GPNMB+小胶质细胞和间充质细胞中特异性表达，其同源配体VEGFA、TGFB和CTGF已被证明可诱导各种器官的纤维形成；另外，受体如IFNGR、CD44、CD74、CCR1和CCR5特异性富集在GPNMB+小胶质细胞和单核细胞中，它们是巨噬细胞动员和激活的关键调控信号（图4）。接着通过与健康视网膜小胶质细胞进行对比，从中鉴定出CCR1、CCR5、IFNGR1、CD44、CXCR4和NRP1，这些受体均在FVM小胶质细胞中显著上调。这些受配体对的鉴定提示：直接靶向干预特殊类型的小胶质细胞是一个崭新的研究治疗策略。

图4促纤维化小胶质细胞在PDR特异性微环境中的单细胞间相互作用

纤维血管膜组织量微小，手术中难以完整分离，导致目前的单细胞研究较少。本研究中作者对5例PDR患者首先完整分离纤维血管膜，再用切割头对纤维血管膜切割、收集，进行单细胞测序。分析发现小胶质细胞是纤维血管膜中最主要的细胞成分，在纤维血管膜组织的形成过程中具有非常重要的作用，其中的小胶质细胞起源于视网膜的小胶质细胞，且表现促纤维化和本身纤维化特性。这些结果为更好地了解人类纤维血管膜的细胞组成和功能以及未来介入靶点的发展提供了理论基础。