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文章信息概述

标题：Amicrobialmetaboliteremodelsthegut-liveraxisfollowingbariatricsurgery

期刊：Cellhostmicrobe

影响因子：15.

日期：-12-30

DOI：10./j.chom..12.

内容简述：减肥手术是目前治疗肥胖相关的2型糖尿病最有效的方法，然而其背后的分子机制在仍然未知。临床研究已确定术后发生的三个主要变化：1)胰高血糖素样肽-I（GLP-1，促进胰岛素分泌）水平上升；2)胆汁酸的变化；3)肠道微生物组成的变化。此外，CA7S（cholicacid-7-sulfate）在SG（袖状胃切除术）后升高。CA7S是G蛋白偶联受体TGR5的前配体，并诱导GLP-1分泌。本研究阐明了SG后CA7S升高的一种微生物依赖的途径：SG后微生物代谢物LCA（石胆酸）从肠道到肝脏的选择性转运激活了肝脏VDR（维生素D受体），从而诱导胆汁酸磺基转移酶SULT2A的表达，产生抗糖尿病分子CA7S（cholicacid-7-sulfate）。这种肠道-肝脏途径的激活致使CA7S合成和GLP-1分泌，促进糖尿病表型的改善。

主要结果

RESULT

01

CA7S的产生和GLP-1的诱导需要微生物组

对抗生素处理与未处理的DIO小鼠（饮食诱导肥胖小鼠）分别进行SG或sham（假手术），术后6周对小鼠实施安乐死，用高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）测定组织中的BA水平（图1A）。结果表明，SG小鼠术后盲肠内容物中CA7S含量高于sham小鼠（图1B）。然而，术前抗生素处理小鼠消除了SG介导的CA7S水平的升高（图1C）。整体来看，CA7S水平在经抗生素处理的小鼠中显著降低（图1B-C）。进一步对常规、抗生素处理以及无菌DIO小鼠的CA7S水平进行定量，发现抗生素处理的小鼠比常规小鼠低到倍，且抗生素处理和无菌小鼠的肝脏中检测不到CA7S（图1D-E）。这表明，CA7S的稳定生产需要微生物组。

CA7S引发TGR5的激活和随后的GLP-1分泌，以改善体内葡萄糖耐受性。GLP-1是SG后糖尿病缓解的主要介质。本研究表明DIO小鼠体内GLP-1循环水平的增加（图1F）。然而抗生素处理DIO小鼠消除了SG介导的GLP-1分泌的增加（图1G）。这表明SG介导的GLP-1分泌需要微生物组。

图1：SG介导的CA7S和GLP-1水平的增加需要微生物组

02

微生物组诱导哺乳动物肝脏合成CA7S

BAs（胆汁酸）的磺化主要通过BA磺基转移酶或SULTs发生在哺乳动物肝脏中（图1H）。已在小鼠中鉴定出三种BA-SULTs亚型（mSULT2A1、mSULT2A2和mSULT2A8）、在人类中鉴定出一种亚型（hSULT2A）。SG后小鼠肝脏中mSult2A1亚型的表达水平比假手术组更高，而mSult2A2或mSult2A8亚型的表达无显著差异（图1I）。因此，SG后小鼠肝脏中mSult2A1表达的增加可能有助于SG小鼠CA7S产生的增加。抗生素处理和无菌小鼠的mSULT2A1表达水平显著低于DIO小鼠（图1J）。这些结果表明，肝脏中CA在mSULT2A1的作用下产生CA7S，需要微生物组。

03

门静脉BAs诱导mSult2A1/hSULT2A表达

基于CA7S的产生需要微生物组的发现，研究者调查细菌相关BAs是否通过门静脉转运到肝脏参与CA7S的产生。研究者开展了如图2A所示的实验方案，结果表明，SG和Sham组小鼠的门静脉中总BA水平无显著差异（图2B-C）。为了测试SG后门静脉BAs是否能诱导BA磺基转移酶的表达，以及这种诱导是否依赖于微生物组，研究者模拟在常规和抗生素处理的Sham组和SG组门静脉中观察到的BAs平均生理比率进行体外实验，去测试这些重组的BAs诱导人肝癌细胞表达β2受体激动剂的能力（图2D-E）。结果表明，与常规鼠Sham组相比，常规鼠SG组门静脉BAs在体外能显著诱导hSULT2A表达。然而，与常规鼠Sham组相比，当细胞与抗生素处理的Sham组门静脉BAs一起孵育时，hSULT2A表达显著降低（图2D-F）。类似的，在小鼠肝细胞中的实验表明SG诱导mSult2A1的表达。此外，在所有测试浓度下，与抗生素处理的Sham组相比，从抗生素处理的SG组中获取的BAs没有诱导hSULT2A的表达（图2E）。这表明，SG后从肠通过门静脉再循环到肝脏的BAs可以在肝细胞中诱导hSULT2A的表达，并且这种诱导依赖于微生物组。

图2门静脉BAs体外诱导肝细胞内hSULT2A的表达

04

LCA通过VDR诱导mSult2A1/hSULT2A表达

鹅去氧胆酸（CDCA）、牛去氧胆酸（TDCA）、胆酸（CA）和石胆酸（LCA）存在于常规Sham组小鼠和SG小鼠的门静脉中，但在抗生素处理的小鼠的门静脉中未检测到（图2B-C）。研究者进一步测试上述4种分子在HepG2细胞中诱导hSULT2A表达的能力。结果表明，LCA以剂量依赖的方式诱导hSULT2A表达（图3A）。当小鼠肝细胞与LCA一起孵育时，观察到类似的mSult2A1表达诱导。此外，SG小鼠的门静脉BA处理后的LCA水平显著高于Sham组（图2B）。综上，SG后微生物代谢物LCA通过门静脉转运至肝脏并诱导肝的mSult2A1表达。

LCA能与法尼醇X受体（FXR或NR1H4）、孕烷X受体（PXR或NR1l2）和VDR等核激素受体结合诱导SULTs的表达。进一步研究表明，siRNA介导的VDR基因敲除显著降低了HepG2细胞中依赖于LCA而增加的hSULT2A的表达（图3B）。VDR激活导致肝细胞中VDR表达的增加，SG小鼠肝的Vdr表达高于Sham组（图3C）。此外，与常规DIO小鼠相比，GF鼠肝脏中Vdr表达水平降低约20倍，且在抗生素处理组中几乎检测不到Vdr的表达（图3D）。这表明肝脏中Vdr的表达需要微生物。BA分析显示，Vdr敲除小鼠粪便中CA7S的水平与野生型动物相比显著降低，表明VDR是小鼠产生CA7S所必需的（图3E）。

将LCA直接注射到DIO鼠的门静脉以测试LCA-VDR-SULT2A1-CA7S通路在活体生物中成立（图3F）。门静脉注射LCA两小时后小鼠肝脏中mSult2A1和Vdr的表达水平显著升高（图3G-H）。此外，胆囊中CA7S水平增加，表明门静脉LCA注射导致了胆囊中CA7S的合成与积聚（图3I）。综上，微生物代谢产物LCA通过门静脉从肠道转运至肝脏，并在肝脏中诱导mSult2A1表达和CA7S的产生，研究结果还表明SG后CA7S水平的增加是由LCA诱导的VDR激活所调控的。

图3LCA通过VDR诱导SULT的表达，引发CA7S和GLP-1的产生

05

LCA触发的CA7S合成诱导GLP-1分泌

为验证LCA诱导的hSULT2A或mSult2A1分别在人或鼠的肝细胞中表达增加，将导致CA7S的合成增加，从而使GLP-1的分泌增加这一假设，研究者调查了CA7S的体外合成。将HepG2细胞与CA（CA7S的前体）一起孵育，导致肝细胞吸收CA增加，但未检测到CA7S；添加PAPS（3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸，SULTs黄化供体的辅因子）导致肝细胞中CA7S的产生；添加LCA导致CA7S产量的显著增加（图3J）。此外，VDR敲除消除了LCA介导的CA7S合成的增加，说明LCA需要VDR激活去诱导肝细胞hSULT2A的表达和CA7S的增加（图3J）。

研究者测试了由HepG2细胞合成的CA7S诱导人肠内分泌L细胞（NCI-H）分泌GLP-1的能力（图3K）。下消化道中的L细胞分泌GLP-1以响应TGR5的激活。NCl-H细胞与HepG2细胞一起孵育诱导CA7S的合成，进一步导致GLP-1的分泌（图3L）。VDR的敲除破坏CA7S的合成，导致GLP-1分泌的减少，表明CA7S介导的GLP-1分泌需要VDR的激活（图3L）。这些结果表明，LCA-VDR-SULT通路在肝-肠轴中起诱导CA7S产生、GLP-1分泌的作用。

06

小鼠盲肠和人类粪便LCA产量在SG后降低

初级胆汁酸CA和CDCA通过梭状芽孢杆菌XIV簇7α-脱羟基作用分别被转化为DCA和LCA（图4A）。尽管SG后小鼠门静脉LCA水平增加，但小鼠结肠LCA水平显著降低。同样，在SG后人类粪便中细菌产BA、LCA减少。这些结果表明，与门静脉相反，小鼠和人类的SG导致结肠中细菌代谢物LCA水平的降低。

为研究肠道LCA水平的降低是否导致SG后肠道LCA产生细菌减少，研究者对Sham组和SG小鼠盲肠内容物进行了16SrRNA测序。结果表明，SG后小鼠肠道菌群发生变化，如拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）增加（图4B-C）。尽管梭状芽孢杆菌（产LCA成员）的平均相对丰度在小鼠SG后降低，但这些差异在统计学上不显著（图4D）。细菌需要在一系列由BA诱导型（bai）操纵子基因编码的酶的作用下合成LCA。LCA生物合成级联中的一种关键酶是3-oxo-/3-oxo-4,5-dehydro-BA氧化还原酶，由bai操纵子中的baiCD基因所编码（图4A）。分析表明，与Sham组相比SG组中baiCD基因的表达显著降低（图4E）。人类粪便样本中，梭状芽孢杆菌的相对丰度在SG后显著降低（图4H）。

综上，SG后菌群的变化导致小鼠和人类肠道内LCS合成的减少。这些数据表明，在SG小鼠门静脉中观察到的微生物代谢物LCA的增加并不是由于肠道细菌增加了LCA的总合成量。

图4在小鼠和人类中，SG后次级胆汁酸的产生减少

07

SG后，Asbt和Ostα在小鼠回肠中过表达

观察结果表明，SG后LCA水平在门静脉中增加但在胃肠通道内降低，作者研究BA转运体在促进LCA选择性转运到门静脉循环中的作用。BAs的主动转运主要发生在回肠，主要由顶端依赖性BA转运体（ASBT或SLC10A2）、有机阴离子转运多肽（OATP或SLC01A2）、蛋白ABC家族成员，包括胆盐输出泵（BSEP或ABCB11）、有机溶剂转运体（OSTα/β或SLC51A/B）以及多耐药蛋白（MRP或ABCC1）等调节。此外，BAs从肠上皮顶端向基底外侧的转运是通过直接结合回肠BA结合蛋白（I-BABP或FABP6）促进（图5A）。研究者用qPCR定量Sham组和SG组小鼠回肠BA转运体的表达水平，结果表明Asbt和Ostα表达水平在SG后显著升高（图5B）。因此，SG似乎增加了参与BA转运至门静脉的蛋白的表达。

08

在肠上皮细胞中LCA主要由ASBT转运

先前研究发现，BAs竞争结合ASBT，并且ASBT的某些氨基酸残基对特定BAs具有不同的结合亲和力，如ASBT转运CDCA和DCA等二羟基BAs比TCA和CA等三羟基更高效。鉴于SG小鼠门静脉LCA增加，研究者假设Asbt和Ostα表达的增加诱导LCA从肠到门静脉循环的主动吸收。为了验证此假设，研究者测量了人类肠道Caco-2细胞中BAs的转运。为了测试LCA是否特异性地通过肠上皮转运，在transwell中分化的Caco-2细胞上面加入一定比例的优势肠BAs（CA/CDCA/βMCA/LCA/DCA/TCA/TβMCA），在12和24小时用UPLC-MS测量向基底外侧隔室的主动转运（图5D）。结果表明LCA的总转运显著高于DCA，说明个别的BA分子可以有不同的转运动力学。接下来，研究者对12h以内的BA转运进行时间节点分析去调查LCA在早期的转运是否更高效，结果表明，LCA似乎没有比其他BAs通过单层上皮的转运效率更高（图5E-F）。然而，siRNA介导的ASBT或OSTα敲除明确阻碍了LCA和TCA跨单层上皮的转运，说明LCA和TCA的细胞转运需要ASBT和OSTα的表达（图5E-F）。此外，ASBT过表达导致LCA通过单层转运的增加，且其他Bas未增加（图5E-F）。这些结果表明，SG小鼠回肠中ASBT和OSTα水平的增加导致LCA进入门静脉的选择性转运增加。

图5肠BA转运蛋白（ASBT和OSTα）促进LCA选择性转运至门静脉

09

SG后LCA水平的降低导致Asbt表达的增加

为进一步研究SG后鼠门静脉中LCA水平增加，而鼠结肠和人类粪便中LCA水平减少的结果，研究者检测了BAs对ASBT（主要的BA转运体）表达的影响。先前研究表明，BAs可以调节ASBT在肠内的表达，非结合性BAs，尤其是LCA和DCA等次级胆汁酸在肠细胞体外实验中抑制ASBT的表达。由于SG小鼠与sham组相比盲肠内容物中LCA水平降低，研究者假设LCA的减少促进了SG组中Asbt表达的增加（图6A）。为了验证这个假设，研究者在模拟sham组合SG组盲肠粪便中平均生理浓度的体外BAs池孵育Caco-2细胞，然后测试重建的BA池在Caco-2细胞中诱导ASBT表达的能力。结果表明，与sham组相比，SG盲肠BAs显著诱导ASBT体外表达（图6B）。综上，SG后肠LCA水平降低导致Asbt表达增加，因此增加门静脉中LCA水平（图6A）。在GF小鼠食物中增加0.3%的LCA7天的体内实验导致整个胃肠道的LCA累积以及下消化道Asbt表达的显著抑制（图6D-F），证明LCA在体内抑制Asbt表达。

此外，研究者发现，LCA足以诱导LCA-VDR-SULT通路并诱导CA7S产生。饲喂LCA的GF小鼠胆囊与肠道中CA7S积聚，且肝脏mSult2A1表达水平显著升高（图6G-H）。因此，尽管LCA降低Asbt在这些动物中的表达，但LCA饲喂能够诱导肝脏CA7S的生物合成。综上，LCA足以诱导GF小鼠产生CA7S。

图6LCA足以抑制Asbt表达以及诱导CA7S产生

10

SG菌群移植重塑GF动物的CA7S通路

术后6周将sham和SG小鼠结肠粪便厌氧匀浆后灌胃给高脂饮食的GF小鼠（粪菌移植，CMT）以测试SG菌群是否可以诱导体内门静脉LCA转运以及LCA-VDR-SULT通路增加（图7A）。两周后检测发现，与sham组相比，SG供体baiCD表达水平显著降低，该效应也转移到各自的CMT受体上（图7B-C）。SG-CMT动物LCA水平显著低于sham-CMT动物，但两组间DCA和总BA水平差异不显著（图7D）。

与体外实验结果一致，体内实验结果表明LCA抑制Asbt和Ostα的表达，SG-CMT鼠回肠末端Asbt和Ostα的表达水平显著高于sham-CMT鼠（图7E）。此外，与sham-CMT鼠相比，SG-CMT鼠LCA门静脉转运增加，而两组小鼠的其他门静脉BAs水平相当（图7F）。这表明SG微生物组诱导LCA通过门静脉从肠到肝的转运增加。SG-CMT鼠肝脏Vdr和mSult2A1表达水平显著高于sham-CMT鼠（图7G）。SG-CMT鼠盲肠内容物CA7S水平显著增加，证明SG微生物组足以诱导CA7S的产生（图7H）。SG-CMT鼠GLP-1水平高于sham-CMT鼠~50%（图7I），且SG-CMT鼠回肠末端Tgr5表达水平显著高于sham-CMT鼠，表明在本实验时间范围内SG后微生物组增加Tgr5表达（图7J）。综上，微生物组足以诱导LCA-VDR-SULT-CA7S通路（图7K）。

图7SG微生物转移至GF小鼠重塑CA7S通路

总结

CONCLUSION

本研究表明，SG（袖状胃切除术）后微生物群的改变，特别是梭菌属的减少，导致LCA（石胆酸）的产生减少，这最终导致糖调节化合物CA7S的产量增加。值得注意的是，SG小鼠的粪菌移植在GF受体小鼠中重建了LCA-VDR-SULT2A1-CA7S通路，具体来说，SG-CMT导致门静脉LCA增加，鼠肝脏Vdr和mSult2A1表达增加，胆囊CA7S水平增加。

此外，LCA-VDR-SULT2A-CA7S-GLP-1通路在体外人肠和肝细胞中是可操作的。与SG小鼠相似，人类粪便SG后也显示出梭菌属水平降低、LCA水平降低和CA7S水平升高，因此LCA-VDR-SULT2A-CA7S-GLP-1通路有助于人类患者SG的糖调节作用的设想是合理的。未来对SG患者的研究可能有助于确定本文所述的途径在人类中是可操作的，本文也许为将来快速治疗T2D铺平了道路。

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